Kinobeads 两浓度激酶工具化合物结合与选择性测绘
以人癌细胞混合裂解液的竞争结合质谱，粗估多靶点亲和力并筛选选择性化学探针候选。
用途与模型
- 研究用途
- 辅助激酶药物发现及机制研究选择工具化合物，识别意外结合，指导正交细胞复验。
- 模型与细胞来源
- K-562、COLO-205、MV-4-11、SK-N-BE(2)、OVCAR-8 5 种人癌细胞系混合裂解液；亲和微珠富集的内源蛋白面板。
- 方法版本
- 2023 年 4 个化合物库/1183 非冗余化合物/5 种细胞混合裂解液版本
- 实验形式
- 100 nM 与 1 μM 竞争结合，无标记质谱定量相对微珠残余结合；对照归一化、靶点分类及浓度与靶点依赖选择性（concentration and target dependent selectivity，CATDS）分析。
材料与平台
- 化合物与面板
- 4 个化合物库 1183 非冗余化合物、64 化学骨架；微珠含 7 种广谱抑制剂，约 300 个人激酶可被富集。
- 重复与剂量参照
- 每板 6 个溶剂对照及 lestaurtinib 重复；50 种临床激酶抑制剂比较两浓度估计与完整剂量曲线。
- 候选复验
- SYK 小鼠树突细胞功能；CK2 重组酶、结构及活细胞靶点结合；PKN3 活细胞结合和人细胞磷酸化反应。
测量指标与分析
- 表观解离常数
- 检测范围内 CATDS 选择性
- 可识别靶点与未命中
- 活细胞靶点结合
- 激酶功能及磷酸化反应
两点表观亲和力仅作粗估。按主要靶点亲和力和选择性筛候选，结合完整曲线、活细胞结合和功能结果；未覆盖靶点不能按阴性解释。
研究设计与结果
实验条件比较
- 研究设计
- 两剂量结合与完整曲线比较，重复对照检查再现性，并对代表性候选进行正交复验。
- 测试范围
- 1183 非冗余化合物；50 种临床抑制剂用于剂量设计比较；SYK 功能实验为小鼠细胞 3 次生物学重复，活细胞结合至少 2 生物/2 技术重复。
- 参照体系
- 溶剂、完整剂量曲线、既往重组蛋白测定，以及活细胞靶点结合和候选对照。
- 研究结果
- 两点/完整曲线 r = 0.808；约 330 探针候选涉及 72 个激酶；CK2 候选活细胞效力弱于裂解液，部分既往靶点测定差异未解决。
适用条件与研究局限
- Kinobeads 仅覆盖部分激酶和其他蛋白，选择性为面板内结论。
- 两浓度对弱结合估计较粗，慢结合及共价候选可能漏检。
- 裂解液不反映完整细胞通透、外排、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）浓度和复合物状态。
- 探针候选不等于临床候选或全面验证完成，磷酸化共同变化不证明直接底物。
来源与原文
- Chemical proteomics reveals the target landscape of 1,000 kinase inhibitors原始研究 · Nature Chemical Biology · 2023-10-30