小胶质细胞与运动神经元共培养的炎症及 MMP9 干预评价
比较患者与对照小胶质细胞对健康神经元的作用，再用短期及较长炎症处理检验 MMP9 抑制。
用途与模型
- 研究用途
- 研究 ALS 相关小胶质细胞的神经毒性，并评价干预分泌蛋白的候选。
- 模型与细胞来源
- 3 名 C9orf72 相关 ALS 患者、3 名匹配健康供者及 1 个同背景纠正细胞系分化的小胶质细胞；共培养神经元统一来自健康 HC-2b 细胞系。
- 方法版本
- 2023 年 C9orf72 患者小胶质细胞与健康运动神经元共培养版本
- 实验形式
- 小胶质细胞单培养、1∶1 混合共培养及 0.4 μm 孔径插入式共培养。
材料与平台
- 共培养
- 运动神经元第 18 天重铺，第 21 天加入小胶质细胞前体，按 1∶1 加入；培养至少 14 天，每 2–4 天半量换液。
- 短期刺激
- 分化第 25、29、33 天给予最终 100 ng/mL LPS，总处理 10 天；MMP9 inhibitor I 3 μM 同时加入，对照 DMSO 0.3%。
- 较长刺激
- 第 25 天起持续 20 天，每隔 1 天换半量含 LPS 培养液，共 10 次；撤去 BDNF/GDNF，另设同浓度 MMP9 抑制剂。
- 直接蛋白处理
- 运动神经元第 21、25 天加入重组人 MMP9 30 ng/mL，另设 3 μM 抑制剂；第 29 天做 MTS 检测。
测量指标与分析
- 上清 MMP9 浓度与活性
- 神经元内活化型 caspase-3 染色面积
- TUJ1 区域内细胞核数量
- DPP4 释放
- 神经元 MTS 活力、放电和神经突面积
神经元计数与 CC3 面积按每次分化健康对照均值归一化；MMP9 与 DPP4 分别用 ELISA、MMP9 另做活性测定。
研究设计与结果
实验条件比较
- 研究设计
- 患者、健康与同背景纠正小胶质细胞分别与同一健康运动神经元共培养；比较无 LPS、10 天 LPS 及撤去营养因子的 20 天 LPS，另设 MMP9 抑制。
- 测试范围
- 主要供者为每类 3 名；同背景配对 1 个细胞系。20 天实验的 CC3 检测 3 次分化、计数 4 次分化；10 天 CC3 检测 4 次分化。
- 参照体系
- 健康与同背景纠正小胶质细胞、溶剂组、MMP9 抑制剂和直接重组 MMP9 处理。
- 研究结果
- 无 LPS 时神经元数量和功能无显著差异；10 天刺激增加患者组 CC3，细胞数仍相近，同背景 CC3 趋势未显著。20 天处理下患者组神经元数量显著减少，MMP9 抑制减轻 CC3 增加和细胞数量下降。
适用条件与研究局限
- 20 天处理同时撤去 BDNF/GDNF，与 10 天条件不同。
- 共培养神经元来自单一健康背景。
- 10 天同背景配对的 CC3 差异未达显著；凋亡标志与神经元数量分别检测。
来源与原文
- C9orf72-ALS human iPSC microglia are pro-inflammatory and toxic to co-cultured motor neurons via MMP9原始研究 · Nature Communications · 2023-09-22