成对 LLC-PK1 屏障的运输检测与脑分布关联
比较猪肾上皮 MOCK 与人 MDR1 转染单层的双向运输，结合回收率和大鼠游离药物分布评价小分子脑暴露。
用途与模型
- 研究用途
- 早期小分子脑暴露筛选、P-gp 外排与细胞蓄积影响评价。
- 模型与细胞来源
- 猪肾上皮 LLC-PK1 细胞系；空载体 MOCK 对照与稳定表达人的多药耐药基因 MDR1 的转染组，后者表达 P-糖蛋白（P-gp）；分别用于被动通透参照和外排评价。
- 方法版本
- 2025 年原研究版本
- 实验形式
- 24 孔 Transwell，6.5 mm 直径、0.4 μm 孔径聚碳酸酯膜，面积 0.33 cm²。MOCK 接种 20,000 个/小室、第 4 天检测；MDR1 接种 10,000 个/小室、第 7 天检测。两组为分别培养的二维单层。
材料与平台
- 培养与屏障检测
- RPMI1640 加 10% 胎牛血清；培养时顶端 200 μL、基底 850 μL。跨上皮电阻扣除空白并乘膜面积；100 μM 荧光素黄检测细胞间通透性。MOCK 使用 3–30 代，MDR1 使用 3–25 代。
- 双向运输
- 汉克平衡盐溶液（HBSS）加入 10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），pH7.4；供体侧 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）、接收侧 1%。37°C 预平衡 30 分钟后给药 2 μM、2 小时；测供体起始及末次浓度、接收侧药物量，计算表观通透系数、外排比和回收率。
- 功能与回收干预
- 地高辛 2 μM，比较有无 5 μM tariquidar；低回收药物用细胞裂解液检测蓄积，并在双向运输中加入 1 μM 巴佛洛霉素 A1（Bafilomycin A1）比较。每批以阿替洛尔、美托洛尔和地高辛作对照。
- 体内参照
- 32 种药物脑分布参照沿用文献或既有研究数据；9 种由雄性大鼠静脉 1 mg/kg 后测量，5 个时间点各 3 只。脑/血浆曲线下面积比经脑组织和血浆游离比例校正为 Kp,uu,brain；缺少的结合数据以 5 μM、37°C、6 小时平衡透析补测。
测量指标与分析
- 表观通透系数
- 外排比
- 液相与细胞内药物回收率
- 跨上皮电阻与荧光素黄通透
- 大鼠 Kp,uu,brain
- 留出预测与体内参照的误差
从 41 种药物面板中分层随机选择 20 种拟合通透系数与大鼠脑内游离分布的对数相关关系，剩余 21 种作留出测试；对低回收的 4 种药物再比较溶酶体干预前后数据。
研究设计与结果
机制研究；药物集评价
- 研究设计
- 成对细胞单层比较地高辛运输，并分别加入 P-gp 抑制剂或溶酶体酸化抑制剂。
- 测试范围
- LLC-PK1-MOCK/MDR1 单层及地高辛等对照药物。
- 参照体系
- MOCK/MDR1、有无 5 μM tariquidar；另一组有无 1 μM Bafilomycin A1。
- 研究结果
- 地高辛外排比 MOCK 为 0.89 ± 0.04、MDR1 为 11.52 ± 1.34；tariquidar 后 MDR1 降至 0.99、MOCK 未显著变化。Bafilomycin 另一组使 MDR1 地高辛外排比 9.73 降至 6.0，阿替洛尔通透性未显著变化。
适用条件与研究局限
- 2 类抑制剂实验使用独立的地高辛对照，起始外排比不同。
- Bafilomycin A1 也降低了地高辛的 P-gp 外排比。
机制研究；药物集评价
- 研究设计
- 20 种药物建立相关拟合，其余 21 种留出测试；4 种低回收药物在干预后重新计算。
- 测试范围
- 41 种药物同一面板；32 种药物的大鼠分布参照沿用文献或既有研究数据，9 种来自本研究动物实验。
- 参照体系
- 两类单层通透系数与大鼠 Kp,uu,brain；留出预测值与体内参照。
- 研究结果
- MDR1 拟合 R 为 0.8886，MOCK 为 0.5984。21 种初始测试中 17 种在 2 倍误差范围内；4 种干预后回收率 80%–120%，预测进入原设误差范围。
适用条件与研究局限
- 测试药物来自同一面板，后续修正采用偏离样本的干预数据，仍需独立药物集检验。
- 蛋白结合超过 99% 时游离比例固定为 0.01，极高结合药物的参照依赖该取值。
- 猪肾上皮替代屏障缺少人脑微血管细胞环境及其他转运体。