患者运动神经元的内源 NEFL 发光筛选与候选确认
在 ALS 患者来源运动神经元中，用内源基因报告寻找提高神经丝轻链表达的分子，再以蛋白、细胞存活与电活动确认作用。
用途与模型
- 研究用途
- ALS 候选分子的表型发现与神经元功能确认。
- 模型与细胞来源
- 50 岁女性患者来源 SOD1 D91A iPSC，分化为脊髓运动神经元；1 个 NEFL 等位基因连接 NanoLuc 报告，后续蛋白实验另用未编辑患者细胞、WC-30 对照及 C9orf72 背景。
- 方法版本
- 2026 年 SOD1 D91A 单等位基因报告细胞、1536 孔多浓度初筛版本
- 实验形式
- 冻存神经元复苏后进入 1536 孔板，每孔 1400 个细胞；24 小时后给药，再经 48 小时测量发光。初筛每个分子设置 5 个或 11 个浓度点。
材料与平台
- 患者细胞与报告系统
- SOD1 D91A 细胞源于 Coriell ND29149；主文也按既往命名写作 SOD1 D90A。NanoLuc 接入 1 个内源 NEFL 等位基因，使用冻存脊髓运动神经元和 BrainFast 等培养支持。
- 药库与检测
- NPC-A、NPC-B、LOPAC 和 MIPE 药库合计 6016 个条目；Nano-Glo 发光试剂、ViewLux 读板器与剂量反应分析。药库条目可能含重复分子。
- 候选确认
- 独立采购的候选样品；NF-L ELISA、平行细胞存活检测与 Axion 多电极阵列。另比较 SMN2/CAG 报告和 TGF-β/SMAD3 磷酸化。
测量指标与分析
- NEFL-NanoLuc 发光剂量反应
- 未编辑运动神经元的内源 NF-L 蛋白
- 平行培养细胞存活
- 运动神经元平均放电率
- 不同 ALS 基因背景的蛋白反应
初筛数据按溶剂对照归一化并拟合多浓度曲线。候选以独立样品再次测试，同时检查细胞存活和报告特异性；ELISA 与电生理作为不同终点分别分析。
研究设计与结果
方法可行性研究
- 研究设计
- 初筛 6016 个药库条目后逐级确认候选，排除蛋白降解相关信号干扰，选择 RepSox 及后续候选。
- 测试范围
- 主要初筛来自 1 个 SOD1 D91A 患者细胞系；复筛用另一批同背景神经元。多电极阵列包括 2 个生物学重复，每个各含 4 个技术重复；后续 ELISA 加入 WC-30 对照和另一个 C9orf72 患者背景。
- 参照体系
- 相应溶剂对照；未编辑细胞的 NF-L ELISA；SMN2/CAG 报告；另外 5 种 TGF-β 受体抑制剂。
- 研究结果
- 71 个初筛候选中，96 孔复筛有 9 个使发光增加超过 20%。RepSox 的 EC50 约为 4 μM，内源蛋白也增加。20 μM RepSox 或 0.5 μM MolPort-042–633–763 可在应激培养中延缓神经元放电活动下降，后者在 SOD1 和 C9orf72 背景中增加 NF-L 蛋白。
适用条件与研究局限
- 主要筛选只覆盖 1 个患者背景；新增 C9orf72 确认也仅为单个背景。
- 高浓度处理造成细胞死亡后，释放的稳定 NanoLuc 仍可产生信号，单凭发光增强无法判断细胞内蛋白是否增加。
- 复筛与 ELISA 的结果段采用先成熟 7 天、处理 3 天的安排；方法段另述先成熟 2 天、处理 48 小时的复筛，以及第 2 天给药、第 7 天 ELISA 的安排。
- 候选的具体分子靶点仍未确定；普通小鼠只用于药代与脑暴露，未开展 ALS 动物疗效或患者结局验证。